Fitc-溶壁酶|FITC-Lyticase

檢測 FITC - 溶壁酶的活性可以采用以下幾種方法：

1.比濁法：

原理：利用溶壁酶分解細(xì)菌細(xì)胞壁使懸液中細(xì)菌細(xì)胞破碎，導(dǎo)致懸液濁度降低，通過測量濁度的變化來反映酶的活性。

操作步驟：

制備底物：使用研缽和研杵將面包酵母研磨成粉末（細(xì)度在 25-30 目之間），用超純水制備成 4mg/ml 的酵母懸液。攪拌約 1 小時后，靜置 30 分鐘，取上部三分之二的上清液作為底物。測量底物在 800nm 處的吸光度，吸光度差值（）應(yīng)在 0.7-1.0 之間，如有必要，可調(diào)整酵母粉或超純水的用量來達(dá)到該吸光度范圍。

設(shè)置反應(yīng)體系：在比色皿中加入適量的磷酸鹽緩沖液（67mM 磷酸鉀緩沖液，pH7.5，25°C）和一定量的 FITC - 溶壁酶溶液，然后加入調(diào)整好的酵母底物懸液，使總體積為 3ml。

測量吸光度變化：使用分光光度計在 800nm 處，每隔一定時間（如每分鐘）測量反應(yīng)混合物的吸光度值。單位定義為：在 pH7.5、25°C 下，在 3ml 反應(yīng)混合物中每分鐘使吸光度降低 0.001 的酶量為一個單位的溶壁酶活性。

2.熒光法：

原理：FITC 本身具有熒光特性，在一定條件下，FITC - 溶壁酶與底物反應(yīng)后，體系的熒光強(qiáng)度會發(fā)生變化，通過檢測熒光強(qiáng)度的變化來測定酶的活性。

操作步驟：

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用已知活性的 FITC - 溶壁酶標(biāo)準(zhǔn)品，在特定的反應(yīng)條件下（如一定的溫度、pH 值和反應(yīng)時間），與不同濃度的底物反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用熒光分光光度計測 量體系的熒光強(qiáng)度，以酶活性為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：將待測的 FITC - 溶壁酶樣品在與標(biāo)準(zhǔn)品相同的反應(yīng)條件下與底物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后測量熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶的活性。

3.平板法：

原理：將 FITC - 溶壁酶作用于含有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基，溶壁酶分解細(xì)菌細(xì)胞壁使細(xì)菌細(xì)胞破裂，形成透明的溶菌圈，通過測量溶菌圈的大小來判斷酶的活性。

操作步驟：

制備含菌平板：將適量的細(xì)菌接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至形成均勻的菌苔。

打孔：在含菌平板上用打孔器打出若干個小孔。

加樣：在小孔中加入一定量的 FITC - 溶壁酶溶液，同時設(shè)置空白對照（加入等量的緩沖液）。

培養(yǎng)與觀察：將平板放置在適宜的溫度下培養(yǎng)一段時間，觀察小孔周圍是否出現(xiàn)透明的溶菌圈。測量溶菌圈的直徑或面積，根據(jù)溶菌圈的大小來判斷 FITC - 溶壁酶的活性。

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